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真菌装试剂时管要垂直

时间: 2025-08-16 16:14:58     来源: flash.chieffocus.com     作者: 影视娱乐

  

(2)测定

①微管柱的真菌制备:以少量脱脂棉作底用铁丝扎实,置于微管柱管架上,毒素的检依次加入高为0.5cm无水硫酸钠(80~100目)、真菌0.5cm硅镁型吸附剂、毒素的检0.5cm无水硫酸钠(80~100目)、真菌1.5cm中性氧化铝,毒素的检1.5cm酸性氧化铝、真菌3cm无水硫酸钠(40~80目),毒素的检顶部以少量脱脂棉堵塞,真菌装试剂时管要垂直,毒素的检每装一种试剂要适当敲紧,真菌两种试剂之间界面要平齐,毒素的检柱管要随装随用,真菌以免在空气中吸水活性下降。毒素的检

②微柱色谱:在装好的真菌微柱中,加入三氯甲烷提取液1.0mL,同时做标准管,另取三支微管柱,各加入三氯甲烷1.0mL,再分别加入黄曲霉毒素B1标准液(0.1μg/mL)0pL、50μL、100μL,相当于黄曲霉毒素B1标准0ng、5ng、10ng,待加液流制顶层时,即加入1.0mL丙酮-三氯甲烷(1+9)展开剂,在加样或展开时,柱管均要保持垂直,待展开剂流完后,即可观察结果。

③结果观察与评定:于波长365nm紫外光灯下观察,将色谱分离后的样品管依次与0μg、5μg、10μng黄曲霉毒素B1标准管比较。若试样柱管内硅镁型吸附层与0管一致,则为阴性(在5μg/kg以下);如试样管中硅镁型吸附层呈蓝紫色荧光环,则为阳性,并需进一步按薄层色谱法进行确证测定,但不需重新提取试样。其操作为:准确吸取原三氯甲烷提取液4.0mL(相当于4g或8g试样)于小蒸发皿内挥干,以少量苯-乙腈混合液(98+2)分数次转入刻度小管中,定容至1.0mL,密塞,混匀,按薄层色谱法确证,并测定黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G3、黄曲霉毒素G2的含量。

(三)高效液相色谱法

1、原理

试样经乙腈-水提取,提取液过滤后,经装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的黄曲霉毒素以三氟乙酸衍生,用带有荧光检测器的液相色谱系统分析,外标法定量。

2、试剂和材料

①黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素岛、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G2的标准品,纯度>99%。

②乙腈:色谱纯、分析纯。

③三氟乙酸:分析纯。

④ 己烷分析纯。

⑤ 水:电导率(25℃)≥0.01mS/m。

⑥ 乙腈-水(84+16)提取液:量取乙腈(分析纯)840mL,加水160mL,混匀。

⑦ 水-乙腈(85+15)溶液:量取乙腈(色谱纯)150mL,加三蒸水850mL,混匀。

⑧ 标准储备液:分别称取黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G20.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g(精确至0.001g),置10mL容量瓶中,加乙腈(分析纯)溶解,并稀释至刻度。此溶液密封后避光-30℃保存,2年有效。

⑨标准工作液:准确移取标准储备液1.00μL,至10mL容量瓶中,加乙腈(分析纯)稀释至刻度。此溶液密封后避光4℃保存,3个月有效。

⑩准系列溶液:准确移取标准工作液适量,至10mL容量瓶中,加乙腈(分析纯)稀释至刻度(含黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素Gl的浓度为0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L;黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2的浓度为0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L的系列标准溶液),注意避光。

3、仪器和设备

①液相色谱系统(HPLC):附荧光检测器。

②色谱柱:反相C18柱,要求4种毒素的峰能够达到基线分离。

③含有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱:MycosepTM226MFC柱或MycosepTM228MFC柱(或其他等效产品)。

④电动振荡器。

⑤漩涡混合器。

⑥烘干箱。

⑦离心机。

⑧真空吹干机,或氮气及水浴锅。

⑨天平:感量为万分之一。

4、分析步骤

(1)试样提取:称取20g经充分粉碎过的试样至250mL锥形瓶中,加入80mL乙腈-水(84+16)提取液,在电动振荡器上振荡30min后,定性滤纸过滤,收集滤液。

(2)试样净化:移取约8mL提取液至多功能净化柱的收集池中。

(3)试样衍生化:从多功能净化柱的收集池内转移2mL净化液到棕色具塞小瓶中,在真空吹干机下60℃±1℃吹干(或在60°C:水浴下氮气吹干,注意不要使液体鼓泡、飞溅)。加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸,密闭混匀30s后,在40℃±1℃烘干箱中衍生15min。室温真空吹干机吹干(或室温水浴下氮气吹干),以200μL水-乙腈(85+15)溶解,混匀30s,1000r/min离心15min,取上清液至液相色谱仪的样品瓶中,供测定用。

(4)标准系列溶液的制备:吸取标准系列溶液各200μL,在真空吹干机下60℃吹干(或在60℃水浴下氮气吹干,注意不要使液体鼓泡、飞溅),衍生化方法同(3)。

(5)测定

①色谱条件

a.色谱柱 12.5cm×2.1mm,5μm,C18。柱温30℃。

b.流动相 乙腈(色谱纯),水,梯度洗脱的变化参考下表。调整洗脱梯度,使4种黄曲霉毒素的保留时间在4~25min。

c.其他条件 流速0.5mL/min。进样量25μL。荧光检测器:激发波长360nm;发射波长440nm。

②测定:黄曲霉毒素按照黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的顺序出峰,以标准系列的峰面积-浓度分别绘制每种黄曲霉毒素的标准曲线。试样通过与标准色谱图保留时间的比较,确定每一种黄曲霉毒素的峰,根据每种黄曲霉毒素的标准曲线及试样中的峰面积,计算试样中各种黄曲霉毒素含量。

参考资料:食品检测技术,版权归原作者所有,如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系。

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